非洲豬瘟熒光定量PCR儀標準化操作流程
一、實驗前準備
1.設備預熱：
開啟
非洲豬瘟熒光定量pcr儀，選擇預運行程序進行系統預熱，建議預熱時間≥30分鐘。檢查各溫控模塊性能，確保溫度波動≤±0.5℃（95℃測試點）。
2.樣本處理：
核酸提?。翰捎蒙唐坊怂崽崛≡噭┖?，按說明書操作獲取DNA模板。提取后的核酸需在2小時內完成檢測，-20℃保存不得超過7日。
試劑準備：配制反應體系（20μL體系）：
（1）2×熒光PCR反應液 10μL
?。?）引物探針混合液 1μL
?。?）酶混合物 0.5μL
?。?）模板DNA 5μL（濃度50-100ng/μL）
?。?）滅菌ddH?O 3.5μL
配置好的反應體系于冰上保存備用，避免反復凍融。
二、實驗操作規程
1.上機設置
選擇ASFV專用檢測程序：
?。?）預變性：95℃ 30s
（2）循環擴增（40 cycles）：
①變性：95℃ 5s
②退火/延伸：60℃ 30s
?、蹮晒獠杉篎AM通道（探針檢測）
2.樣本裝載
將配置好的反應管裝入加熱模塊，確認：
?。?）管蓋密封完好
?。?）試管無氣泡殘留
（3）樣本編號與軟件對應
設置陰性對照（N/C）、陽性對照（P/C）和標準品，建議每板設置3個N/C。
3.儀器運行：啟動PCR程序，實時監控擴增曲線。正常狀態下，陰性對照應無S型擴增，陽性對照CT值應在18-25之間。
三、結果分析與報告
1.數據分析
CT值判定標準：
（1）CT≤30且呈現典型S型曲線為陽性
?。?）CT＞35或無擴增曲線為陰性
?。?）30＜CT≤35需重復驗證
FAM通道Ct值≤閾值（可參照試劑盒要求）判定為ASFV核酸陽性。
2.報告生成
報告內容應包含：
（1）樣本編號及來源；
?。?）CT值及擴增曲線圖；
（3）陽性/陰性判定結果；
（4）檢測及復核人員簽名；
（5）檢測日期及實驗室信息；
3.廢棄處理：實驗結束后，生物危害廢棄物需按規程處理，反應管置于專用廢料桶中。
四、非洲豬瘟熒光定量pcr儀注意事項
1.操作全程必須穿戴防護服和手套；
2.每批次實驗需同時設立陰、陽性對照；
3.儀器表面每日使用75%乙醇消毒；
4.建議每月使用標準物質進行儀器校準；
5.當檢測結果異常時，必須進行復檢確認。
本操作流程嚴格遵循GB/T 40947-2021《非洲豬瘟診斷技術》國家標準，規范化的操作可有效預防交叉污染，確保檢測結果的準確性和重復性。實驗室需建立完整的質量控制體系，定期對操作人員進行專業培訓，為非洲豬瘟防控工作提供科學依據。
